Mesenchymale Stammzellen. Zelltherapie. Stroma

Forschung aktuell Juli 2008

Transfusion Medicine and Hemotherapy 2008; 35:146-264 (Juni 2008) gibt einen umfassenden Überblick über mesenchymale Stammzellen (MSC).

Das Editorial und die Zusammenfassungen sind frei zugänglich: Bieback, K.: Basic Biology of Mesenchymal Stem Cells; 35:151-152 Article (PDF 75 kB)
MSC sind mögliche neue Zelltherapeutika, die in Zukunft bei verschiedenen Indikationen eingesetzt werden könnten:

• Als essenzielle Regulatoren der Blutbildung im Knochenmark (KM) sind sie wichtige Kofaktoren für die Expansion von Blutstammzellen (z. B. wenn Nabelschnurblut als Ausgangsstoff für Stammzelltherapien bei Erwachsenen zur Anwendung kommt).
• Im Rahmen der regenerativen Zelltherapie ist die Anwendung als Zellersatz denkbar, da die Differenzierung in verschiedene nicht hämatogene Zelltypen gelungen ist: Knochen, Knorpel; möglicherweise auch Herzmuskel, Nervenzellen u. a. (kontroversielle Daten!).
• MSC sind sehr potente Immunmodulatoren, sodass vielfältige Einsatzmöglichkeiten offen stehen. Derzeit wird die starke immunsuppressive Wirkung bei der Behandlung von GVH (Graft Versus Host) ausgenützt. Studien in der  Transplantationsmedizin sind unter www.clinicaltrials.gov (search: MSC) abrufbar.

Trotz der klinischen Anwendungen darf aber nicht übersehen werden, dass viele Fragen derzeit noch völlig offen sind. Der Stand des aktuellen Wissens ist in den folgenden Arbeiten kompakt und übersichtlich dargestellt.

Schon bei der Definition der im KM vorkommenden nicht hämatopoietischen Stammzellen gibt es Unklarheiten:
Ratajczak, M.Z. et al.: Bone Marrow – Home of Versatile Stem Cells; 35:248-259  
Nomenklatur: Im Knochenmark (KM) findet sich neben den hämatologischen Stammzellen (HSC) eine heterogene Population von nicht hämatopoetischen Stammzellen:

1. mesenchymale Stammzellen (MSC – dieses Akronym kann auch für Marrow Stromal Cell stehen): Diese Zellen haben ein sehr ähnliches Differenzierungspotenzial und sind für die Entwicklung der normalen Blutbildung notwendig (siehe auch Wagner et al. und Stammzellnische* ).
2. endotheliale Progenitorzellen (EPC)
3. multipotente adulte Stammzellen (MAPC)
4. Marrow-Isolated Adult Multilineage Inducible (MIAMI) Cells
5. multipotente adulte Progenitorzellen (MACS)
6. Very Small Embryonic-Like (VSEL) Stem Cells

Es ist sicher, dass zwischen den hier angeführten Zelltypen Überlappungen bestehen. Verschiedene Arbeitsgruppen dürften mit unterschiedlichen experimentellen Strategien ähnliche Populationen detektiert haben. Unbestreitbar besitzt aber das KM ein für Stammzellen besonders attraktives Microenvironment.  

MSC sind an vielfältigen Reparaturmechanismen im Organismus beteiligt. Viele dieser Vorgänge sind seit langem bekannt.                     
Schäfer, R.; Northoff, H.: Characteristics of Mesenchymal Stem Cells – New Stars in Regenerative Medicine or Unrecognized Old Fellows in Autologous Regeneration?; 35:154-159

Historische Entwicklung: Bereits im 19. Jh. spekulierte J. F. Cohnheim über eine mögliche Beteiligung der Knochenmarksfibroblasten bei der Wundheilung.

• 1960–1970: A. Friedenstein et al. zeigten in ihren bahnbrechenden Arbeiten, dass fibroblastoide Zellen aus dem Knochenmark Kolonien bilden und sowohl in vivo wie auch in vitro zu osteogenen Zellen ausreifen können.
• 1980 gelang der Nachweis von CFU-F (Colony Forming Units – Fibroblasts) beim Menschen. Die CFU-F-Testung dient heute zur Quantifizierung der MSC in verschiedenen Geweben.
• 1990 konnten A. Caplan et al. zeigen, dass sich aus MSC auch Knorpel- und Muskelzellen entwickeln. Heute wird zumindest ein Trilineage-Differenzierungspotenzial gefordert, um von MSC zu sprechen (Knochen-, Knorpel-, Fettzellen).

In der Folge wurden Beobachtungen publiziert, die eine breitere Plastizität der MSC mit Differenzierungspotenzial in Kardiomyozyten, Pneumozyten, renalen Tubuluszellen u. a.  vermuten lassen. In vivo und in vitro wurde auch eine Transdifferenzierung von MSC zu Zellen mit neuroektodermalen Eigenschaften beschrieben. Doch diesen Zellen fehlen essenzielle Funktionen von Neuronen wie die Bildung von Nervenfortsätzen und das typische elektrophysiologische Verhalten.

Da nur ein sehr kleiner Teil der MSC längere Zeit im transplantierten Organismen nachweisbar ist, müssen auch durch MSC initiierte parakrine Effekte (Sekretion von Zytokinen) intensiv untersucht werden.

• 2005 definierte die International Society of Cellular Therapy  ISCT http://www.celltherapysociety.org

Minimalkriterien zur Charakterisierung von MSC. Dadurch soll die Vergleichbarkeit von Resultaten verschiedener Studiengruppen erleichtert werden.                                                   

Das Oberflächenantigenmuster kultivierter, nicht stimulierter MSC in der Durchflusszytometrie sieht folgendermaßen aus:
Positiver Nachweis von CD73, CD90, CD105.
Folgende Oberflächenmarker sollten negativ sein: CD14 (oder CD11b), CD34, CD45, CD79 α (oder CD19), HLA-DR.

Die von der ISCT geforderte Fähigkeit der Zellen zur plastischen Adhärenz ist möglicherweise kein essenzieller Aspekt, weil auch nicht adhärente MSC-Subpopulationen kürzlich beschrieben wurden.

Hervorzuheben ist, dass die Eigenschaften von MSC (auch das Markerprofil) von der Umgebung beeinflusst werden.

Rojewski, M.: Phenotypic Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Various Tissues; 35:168-184
In der Arbeit werden die Diskrepanzen der Expressionsprofile von MSC durch die unterschiedliche Herkunft der Zellen, das Alter (vielleicht auch das Geschlecht) des Spenders, die Isolationsprozedur und die Kulturbedingungen erklärt.

Genaueres zu den Kulturbedingungen von MSC, die aus verschiedenen Quellen stammen, ist der Arbeit einer französischen Arbeitsgruppe zu entnehmen:
Bourin, P. et al.: Mesenchymal Progenitor Cells: Tissue Origin, Isolation And Culture; 35:160-167

MSC lassen sich als adhärente Zellen leicht isolieren. Neben dem KM ist das Fettgewebe eine attraktive alternative Quelle zur Gewinnung. Aus 1g Fettgewebe können bei entsprechenden Kulturbedingungen nach 14 Tagen 108 ASC = Adipose-Derived Stromal Cells gewonnen werden. Die Eigenschaften dieser Zellen sind denen der MSC gleichzusetzen, allerdings können sie im Gegensatz zu MSC den Oberflächenmarker CD34 exprimieren. Fettgewebe enthält 100-mal mehr ASC als das Knochenmark MSC. Die Gewinnung von Zellen für therapeutische Zwecke wäre, sollten sich die bisherigen Erwartungen erfüllen, gesichert.
International Federation of Adipose Therapeutics and Science http://www.ifats.org

Problematischer ist die Gewinnung von MSC aus Nabelschnurblut. Es bestehen folgende praxisrelevante Probleme:

• Maximalzeit von der Abnahme bis zum Kulturbeginn: 15 Stunden
• Erforderliche Mindestmenge an Nabelschnurblut >33 ml

Damit lassen sich auch unter optimalen Bedingungen nur bei etwa 60 % der frischen Nabelschnüre MSC isolieren. Die zu erwartende Zellzahl ist überdies geringer als aus anderen Quellen, allerdings ist die Proliferationsrate höher. Aus kryokonservierten Nabelschnüren ist die Erfolgsrate verschwindend gering (0–19%). Erfolg versprechender scheint im Vergleich die Gewinnung von MSC aus Amnionflüssigkeit.

Ein entscheidender Regulationsmechanismus der Hämatopoiese und der HSC ist das Microenvironment des KM. Da MSC die Vorläufer für alle Zellkomponenten des Knochenmarksstroma sind, liegt es nahe, MSC als In-vitro-Modellsystem der Stammzellnische zu verwenden.

Wagner, W. et al.: The Stromal Activity of Mesenchymal Stromal Cells; 35:185-193
Die Expansion von HSC ist seit Jahren ein wichtiges Forschungsgebiet. Neue Mobilisierungstrategien (z. B. Gabe des CXCR4-Antagonisten AMD3100) wirken synergistisch mit G-CSF und erhöhen die Ausbeute an HSC bei den „poor mobilizern“.

Voraussetzung für die breite Verfügbarkeit  von wirksamen Zelltherapien ist die Expansion und Differenzierung von Stammzellen in vitro. Bei der Erforschung des Differenzierungspotenzials rücken epigenetische Phänomene in den Mittelpunkt des Interesses:
Collas, P. et al.: Epigenetic Basis for the Differentiation Potential of Mesenchymal and Embryonic Stem Cells; 35:205-215
Die Kenntnis der Vorgänge auf molekularer Ebene und ihrer Kontrollmechanismen sind vor allem auch für die Erfassung eines onkogenen Potenzials von MSC, die therapeutisch eingesetzt werden, von Bedeutung.

Transkriptionsfaktoren steuern die Differenzierung in bestimmte Zelllinien: Frith, J.; Genever, P.: Transcriptional Control of Mesenchymal Stem Cell Differentiation; 35:216-227  
In übersichtlichen Diagrammen wird die Expression der Faktoren und der durch sie beeinflussten Gene bei der Entwicklung von MSC zu Osteoblasten, Adipozyten und Chrondrozyten dargestellt. Wie komplex das Netzwerk ist, zeigen die Autoren am Bespiel der hormonellen Einflüsse (Insulin, Glukokortikoide) auf die Adipozytenreifung.

Dem Differenzierungspotenzial von MSC sind zwei weitere Arbeiten gewidmet:
Gimble, J. M. et al.: In Vitro Differentiation Potential of Mesenchymal Stem Cells; 35:228-238   
Quinn, C.; Flake, A.W.: In Vivo Differentiation Potential of Mesenchymal Stem Cells: Prenatal and Postnatal Model Systems; 35:239-247

Die letzte hier angeführte Arbeit beschäftigt sich mit dem immunologischen Potenzial der MSC: Bifari, F. et al.: Immune Modulation by Mesenchymal Stem Cells; 35:194-204

Die Autoren beschreiben die leistungsstarken regulatorischen Zellen als eine Art Gegenstück zu den dendritischen Zellen (DC).
MSC sezernieren eine Vielzahl regulatorischer Moleküle, die in die verschiedensten Immunvorgänge eingreifen: z. B. IFNγ, Il1β, TGF β, IDO (Indoleamine-2,3-dioxygenase); Prostaglandin E2; NO; HGF; Hemoxygenase u. a.
Alle wichtigen Immunzellen (T- und B-Lymphozyten, NK-Zellen, DC) können beeinflusst werden. Die Wirkungen sind von der Herkunft der MSC, der Zelldosis, aber auch von der Art der Verabreichung abhängig. Eingriffe in dieses komplexe Netzwerk können mit unerwarteten Nebenwirkungen verbunden sein, sodass sorgfältige präklinische und klinische Studien notwendig sind. Dazu kommt, dass ein onkogenes Potenzial der MSC nicht auszuschließen ist. Trotzdem bestehen Hoffnungen, eine Vielzahl von Erkrankungen (GVHD, Krebserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, multiple Sklerose u. v. a.) mit dieser neuen Therapie beeinflussen zu können.

Weitere Literatur:
* hämatopoetische Nische:
Forschung aktuell 5.2006: Immunologie/Microenvironment: Auf die Nische kommt es an!
Nature: Web Focus Stem Cells: http://www.nature.com/reviews/focus/stemcells/index.html
Anne Wilson & Andreas Trumpp: Bone-Marrow Haematopoietic-Stem-Cell Niches
Forschung aktuell 5.2008: Embryonale Stammzellen, Reprogramming, Tumorstammzellen, Mobilisierung hämatologischer Stammzellen